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如何正確使用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗

發(fā)布日期: 2025-04-11
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   多孔細(xì)胞培養(yǎng)板(如6孔、12孔、24孔、96孔板等)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗中常用的工具,廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、毒性測試、基因轉(zhuǎn)染等研究。正確使用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板對實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性至關(guān)重要。
 
  1.實(shí)驗前的準(zhǔn)備
 
 ?。?)選擇合適的培養(yǎng)板
 
  多孔細(xì)胞培養(yǎng)板有不同的孔數(shù)和規(guī)格,需根據(jù)實(shí)驗需求選擇:
 
  -96孔板:適用于高通量篩選(如MTT、CCK-8檢測)。
 
  -24孔或12孔板:適用于中等規(guī)模實(shí)驗(如細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)染)。
 
  -6孔板:適用于較大規(guī)模培養(yǎng)(如蛋白提取、RNA提取)。
 
 ?。?)培養(yǎng)板的預(yù)處理
 
  -無菌處理:新開封的培養(yǎng)板可直接使用,若重復(fù)使用需嚴(yán)格滅菌(如紫外線照射或酒精浸泡后烘干)。
 
  -包被處理:某些貼壁細(xì)胞(如原代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)需提前用多聚賴氨酸、膠原或明膠包被,以增強(qiáng)細(xì)胞貼附。
 
 ?。?)細(xì)胞準(zhǔn)備
 
  -選擇處于對數(shù)生長期的健康細(xì)胞。
 
  -用胰酶消化后,離心收集細(xì)胞,調(diào)整至適當(dāng)密度(如1×10?~1×10?cells/mL,具體依細(xì)胞類型而定)。
 
  2.細(xì)胞接種
 
 ?。?)計算接種密度
 
  不同孔板的接種體積參考:
 
  -96孔板:每孔100-200μL(約5×10³~1×10?cells)。
 
  -24孔板:每孔0.5-1mL(約1×10?cells)。
 
  -6孔板:每孔2-3mL(約2×10?~5×10?cells)。
 
 ?。?)均勻接種
 
  -使用移液槍輕柔吹打細(xì)胞懸液,避免氣泡。
 
  -沿孔壁緩慢加入液體,防止細(xì)胞聚集在中央。
 
  -接種后輕搖培養(yǎng)板,使細(xì)胞分布均勻。
 
 ?。?)培養(yǎng)條件
 
  -將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中。
 
  -接種后靜置2-4小時,待細(xì)胞貼壁后再移動培養(yǎng)板。
 
  3.細(xì)胞增殖檢測
 
  (1)顯微鏡觀察
 
  每日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況及污染。
 
 ?。?)細(xì)胞計數(shù)法
 
  -使用臺盼藍(lán)染色法計數(shù)活細(xì)胞。
 
  -或采用自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行定量分析。
 
 ?。?)CCK-8或MTT法
 
  -CCK-8法:向每孔加入10%CCK-8溶液,孵育1-4小時后測450nm吸光度。
 
  -MTT法:加入MTT溶液(終濃度0.5mg/mL),孵育4小時,溶解甲瓚后測570nm吸光度。
 
  (4)EdU/BrdU標(biāo)記
 
  通過DNA合成標(biāo)記檢測增殖細(xì)胞,結(jié)合熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)分析。
 
  4.實(shí)驗注意事項
 
 ?。?)避免污染
 
  -所有操作需在超凈臺中進(jìn)行。
 
  -培養(yǎng)板開蓋時間盡量縮短,避免細(xì)菌或真菌污染。
 
 ?。?)邊緣效應(yīng)
 
  -96孔板邊緣孔液體蒸發(fā)較快,可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差,可用PBS或培養(yǎng)基填充外圍孔以減少影響。
 
  (3)細(xì)胞均勻性
 
  -接種前充分混勻細(xì)胞懸液,避免細(xì)胞成團(tuán)。
 
  -培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱時保持水平,防止液體分布不均。
 
 ?。?)數(shù)據(jù)重復(fù)性
 
  -每組實(shí)驗至少設(shè)3個復(fù)孔,提高數(shù)據(jù)可靠性。
 
  -使用同一批次培養(yǎng)板,減少批次差異。
 
  5.實(shí)驗結(jié)束后的處理
 
  -廢棄的培養(yǎng)液和細(xì)胞需經(jīng)消毒處理(如84浸泡或高壓滅菌)。
 
  -一次性培養(yǎng)板按生物廢棄物處理,可重復(fù)使用的需清洗并滅菌。
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